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探究人臍帶間充質(zhì)干細胞生物特性比較論文
引言 Introduction
間充質(zhì)干細胞是一類起源于中胚層的非造血干細胞，具有多向分化的潛能，能夠為細胞治療提供理想的種子細胞，同時也能作為基因治療的載體細胞，目前已從骨髓、胎盤、脂肪、臍血、臍帶、滑膜等組織器官中分離出間充質(zhì)干細胞。體外培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞形態(tài)均一，平行生長或漩渦狀生長，能夠表達多種表面抗原，如高表達間質(zhì)細胞標志(CD44、CD90、CD105)，不表達造血干細胞標志(CD34、CD45、CD14)、內(nèi)皮細胞標志(CD31、CD33)及人白細胞抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)等。在特定條件下間充質(zhì)干細胞可以分化為成骨細胞、神經(jīng)細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成纖維細胞及肝細胞等。相比其他間充質(zhì)干細胞，本實驗選用的人臍帶間充質(zhì)干細胞具有種子細胞的很多優(yōu)良特性，如增殖活性高、免疫原性低、無致瘤性等，且來源充足，無倫理問題�，F(xiàn)階段用于分離間充質(zhì)干細胞的方法主要有以下幾種：貼壁組織塊法、流式細胞儀分選法、膠原酶消化法及其改進方法等。每種方法各有利弊，貼壁組織塊法原代培養(yǎng)時間較長，液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長出細胞的能力，減少了細胞數(shù)量，但細胞活性保持良好。流式細胞儀分選法雖然所獲得的細胞純度較高，但實驗成本較大，亦難獲得足夠的細胞數(shù)量。普通膠原酶消化法費用較高，雖然可在短時間內(nèi)獲得細胞，但常溫中消化時間長可能損傷細胞，致使細胞不易貼壁，不易傳代;消化時間短液體較黏稠，難以離心獲得足夠量細胞。胰酶冷消化法曾用于培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，與溫胰蛋白酶消化法比較，胰酶冷消化法所需實驗條件簡單，因為不需攪拌和多次酶消化、清洗的煩瑣過程，胰蛋白酶用量少，節(jié)約大量的人力物力，而且冷消化相對細胞活性損傷較輕。本實驗首次采取胰酶冷消化法分離臍帶間充質(zhì)干細胞[23]，從細胞形態(tài)、生長曲線、細胞表面標記物及誘導分化能力4個方面與傳統(tǒng)組織塊法比較，為不同需求的科研工作者獲得較多的臍帶間充質(zhì)干細胞、更完整的細胞結(jié)構(gòu)及其功能以滿足實驗要求并能達到更節(jié)約人力、物力提供一些資料。
1 材料和方法 Materials and methods
設(shè)計：對比觀察細胞學實驗。
時間及地點：實驗于2013年6月至2014年3月在新疆醫(yī)科大學干細胞研究室完成。
材料：足月健康新生兒臍帶組織取自新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，產(chǎn)婦及家屬均知情同意，采集后裝于盛有無菌生理鹽水的50 mL離心管中，4 h內(nèi)處理。
實驗方法：
臍帶間充質(zhì)干細胞的原代培養(yǎng)：胰酶冷消化法：取足月健康新生兒臍帶組織，剔除組織中的血管，用PBS反復沖洗去除血跡，剪碎至大小約1 mm3，放入50 mL離心管中，加入PBS離心(1 200 r/min)5 min，洗滌3遍，之后取離心后的組織塊放入培養(yǎng)皿中并加入稀釋后的胰酶(PBS與胰酶同比例混合)10 mL，用封口膜封死培養(yǎng)皿邊緣，放入4 ℃冰箱過夜。第2天取出培養(yǎng)皿中的組織于50 mL離心管中，放入37 ℃水浴箱中15 min，之后加入L-DMEM用巴氏管充分吹打，靜置1 min待組織塊沉底后吸取上清液于15 mL離心管中。上述步驟重復操作2遍，盡量收集上清液，加入15 mL離心管離心(1 200 r/min)10 min，去除上清液加入含體積分數(shù)為20%胎牛血清培養(yǎng)液�；靹蚝蠹尤肱囵B(yǎng)皿中，放入37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液1次。培養(yǎng)14 d左右，當細胞達到大部分融合時，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移到一個新的培養(yǎng)皿中，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法：取足月妊娠分娩胎兒臍帶，用PBS洗滌數(shù)遍，去除殘留血跡。把臍帶剪切成4.0 cm左右的片段并剔除血管(1條臍靜脈，2條臍動脈)，之后將其剪成大小約1 mm3的組織塊，然后平攤置于55 mm培養(yǎng)皿中并加入2 mL胎牛血清加以固定。2 h后，按比例加入含有青鏈霉素、谷氨酰胺、維生素C及碳酸氫鈉的L-DMEM培養(yǎng)基約8 mL，放置在37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d半換液1次。觀察貼壁組織周圍的細胞生長情況，當細胞達到80%-90%融合度時，用胰酶消化傳代，并將組織轉(zhuǎn)移到一個新的培養(yǎng)皿中，按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)。
臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學特性：細胞形態(tài)：兩種方法培養(yǎng)的原代細胞通過普通倒置顯微鏡觀察其形態(tài)變化。生長曲線：取上述兩組第2代臍帶間充質(zhì)干細胞以每孔5×103/cm2的濃度接種于24孔板中。采用胰酶消化錐蟲藍染色法，每日取4孔計數(shù)細胞，繪制細胞生長曲線，細胞達到生長抑制時停止實驗。流式細胞儀檢測細胞表面標記特征：胰蛋白酶消化第3代臍帶間充質(zhì)干細胞，1 200 r/min離心5 min，細胞重懸。調(diào)整細胞濃度為1×106 L-1，與抗CD29，CD34，CD45，CD105單克隆抗體室溫反應30 min，PBS洗滌2次后，與FITC或PE標記的二抗避光作用30 min，將洗滌后的細胞重懸于PBS中，待測。誘導臍帶間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)干細胞：取傳至第3代的臍帶間充質(zhì)干細胞，置于誘導培養(yǎng)基(含2%B27、20 μg/L堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L表皮生長因子的DMEM/F12培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。取誘導第3天的臍帶間充質(zhì)干細胞，行熒光免疫化學檢測，細胞爬片在室溫下用40 g/L多聚甲醛固定，經(jīng)PBS預清洗，血清封閉，滴加兔抗人神經(jīng)巢蛋白抗體(1∶400)，置濕盒中4 ℃下過夜。加入Alexa Fluor 594標記的羊抗兔IgG抗體(1∶200)，37 ℃下孵育0.5 h。以PBS作為陰性對照。
主要觀察指標：①兩種方法培養(yǎng)的原代臍帶間充質(zhì)干細胞最早出現(xiàn)時間及培養(yǎng)周期。②兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的形態(tài)。③兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線。④兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞表面標記特征。⑤兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞多向分化的潛能。
統(tǒng)計學分析：用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件處理，做t 檢驗，P < 0.05為差異有顯著性意義。
2 結(jié)果 Results
2.1 兩種方法培養(yǎng)的原代臍帶間充質(zhì)干細胞最早出現(xiàn)時間及培養(yǎng)周期
使用上述兩種方法均可獲得人臍帶間充質(zhì)干細胞，組織塊法在種植后第5-7天才見到細胞從組織塊爬出，最早觀察細胞貼壁時間為(5.80±0.84) d，而胰酶冷消化法在消化種植后第2，3天就可見到細胞貼壁生長，最早觀察細胞貼壁時間為(2.60±0.55) d，差異有顯著性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的原代細胞達到90%-95%融合的時間差異無顯著性意義(P > 0.05)，組織塊法為(14.4±1.67) d，胰酶冷消化法為(14.6±0.90) d。
2.2 兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞形態(tài)觀察及生長情況
胰酶冷消化法培養(yǎng)兩三天就可見單個貼壁細胞，呈圓形或短梭形，培養(yǎng)10 d左右，細胞形態(tài)逐漸伸展開來，大體呈長梭形，但少數(shù)細胞邊緣不光滑，為多角形，不規(guī)則，細胞的體積較大，培養(yǎng)2周之后，細胞已逐漸形成漩渦狀的集落，且逐漸變大，細胞增多，即可傳代。傳代后的細胞生長速度明顯增快，數(shù)量增多，四五天即可傳代1次。組織塊法培養(yǎng)5 d左右亦可觀察到個別細胞沿組織塊邊緣爬出，呈短梭形、纖細;隨后細胞數(shù)量增多，慢慢向外擴長，形態(tài)類似成纖維細胞，并逐漸形成漩渦狀的集落，培養(yǎng)13-16 d，可見細胞集落逐漸變大，細胞增多，即可傳代。
2.3 第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞的生長曲線
兩組細胞的增殖曲線近似“S”型，細胞種植后第一二天處于潛伏期，從第3天起細胞開始進入對數(shù)增殖期，于第8天左右進入平臺期;組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著快于胰酶冷消化法，在進入對數(shù)生長期后的各個時間點細胞數(shù)量差異有顯著性意義(P < 0.05)。
2.4 兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞表面抗原檢測
為了明確臍帶來源貼壁生長細胞是否與骨髓間充質(zhì)干細胞具有相同的抗原標志表達，取上述第3代臍帶間充質(zhì)干細胞樣細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示，上述細胞不表達CD34，CD45，而表達CD29、CD105，即表達了骨髓間充質(zhì)干細胞的常見抗原標志。
2.5 兩種方法培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)干細胞多向分化的潛能
兩種方法培養(yǎng)出來的第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞加入誘導液后第2天均可看到部分細胞聚集成團漂浮于誘導液當中，呈橢圓形或圓形，隨著誘導時間增長，漂浮的神經(jīng)球樣細胞越來越多，且越來越大，免疫熒光顯示神經(jīng)球樣細胞表達神經(jīng)干細胞特征性標志物nestin陽性。
3 討論 Discussion
臍帶是聯(lián)系胎兒與胎盤的一種管狀結(jié)構(gòu)，在胎兒正常分娩時被當作廢棄物丟棄。故利用臍帶來分離擴增間充質(zhì)干細胞屬于變廢為寶，幾乎不涉及倫理道德問題，易于收集，不易污染，可以在短時間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的細胞;其次，臍帶間充質(zhì)干細胞比較原始，分化、增殖分化能力強，生物活性穩(wěn)定，而骨髓間充質(zhì)干細胞在骨髓內(nèi)含量較少且增殖能力隨著年齡的增長而顯著下降，故易受到供者年齡的限制。Weiss等也通過CFU-F培養(yǎng)法檢測顯示臍帶中間充質(zhì)干細胞含量明顯多于骨髓液。因此臍帶間充質(zhì)干細胞以其獨特的優(yōu)點，逐漸成為干細胞中最具有應用前景的種子細胞。
本實驗使用上述兩種方法均可獲得臍帶間充質(zhì)干細胞，組織塊法在種植后第5-7天才見到細胞從組織塊爬出，而胰酶冷消化法在消化種植后兩三天就可見到細胞貼壁生長，差異有顯著性意義(P < 0.05)。但兩種方法得到的細胞達到90%-95%融合的時間差異無顯著性意義(P > 0.05)，鏡下可見細胞均為貼壁生長，呈成纖維細胞樣，但胰酶冷消化法培養(yǎng)的少數(shù)細胞呈多角形，不規(guī)則，細胞的體積較組織塊法大。組織塊法獲得第3代細胞的增殖速率顯著快于胰酶冷消化法，在進入對數(shù)生長期后的各個時間點細胞數(shù)量差異有顯著性意義(P < 0.05)，提示冷消化法對原代的臍帶間充質(zhì)干細胞有損害作用。兩種方法獲得的細胞經(jīng)3代以上培養(yǎng)，均呈現(xiàn)長梭形貼壁形態(tài)，與骨髓間充質(zhì)干細胞為金標準一樣，具有與其相同的表面標志，如表達CD29、CD105，不表達CD34、CD45，具有間充質(zhì)干細胞的特性。臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)誘導后呈現(xiàn)神經(jīng)球樣形態(tài)，漂浮于誘導液當中，表達神經(jīng)干細胞特異性標志——nestin蛋白;進一步將這些細胞球分離成單細胞懸液，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單個的細胞又很快變成類似原代培養(yǎng)時出現(xiàn)的島嶼狀細胞球，充分顯示了神經(jīng)干細胞有別于一般神經(jīng)細胞的增殖特性，說明人臍帶間充質(zhì)干細胞在特定的培養(yǎng)液中具備形成神經(jīng)干細胞的潛力和特性;實驗中所采用的培養(yǎng)條件可以保證神經(jīng)干細胞的生成與存活環(huán)境，有人把神經(jīng)球繼續(xù)誘導可以表達NSE、GFAP、NF-M、S100、Tubulin等神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)特異性表達標志物，為將來以誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞成神經(jīng)干細胞作為種子細胞進行體內(nèi)移植治療脊髓損傷提供了實驗依據(jù)。
實驗結(jié)果顯示：胰酶冷消化法與組織塊法均能培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞，具有相同的表面標志及誘導成神經(jīng)干細胞的能力。組織塊法的優(yōu)點：簡單易行，無需放入4 ℃冰箱過夜，操作時間短，而且原代培養(yǎng)時間也與酶消化法無明顯差異，細胞形態(tài)保持良好的長梭形，此法對細胞無明顯損害，細胞活性較冷消化法強。缺點：液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長出細胞的能力，減少了細胞數(shù)量。胰酶冷消化法通過研究僅原代細胞爬出時間較組織塊法早，其他無明顯優(yōu)勢，故胰酶冷消化法雖然可以同樣培養(yǎng)出人臍帶間充質(zhì)干細胞，但并沒有想象中有那么多優(yōu)點，相對而言操作變得煩瑣且時間長，細胞形態(tài)也受到損害。故對于培養(yǎng)人臍帶間充干細胞，組織塊法要優(yōu)于胰酶冷消化法。
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