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來比林對抗慶大霉素耳毒性的實驗
作者：郭淑云 孫曉莉 黃維國 劉順利
【關鍵詞】 慶大霉素/毒性
Lysisin aspirin protects against gentamicin ototoxicity
【Abstract】 AIM: To study the prevention of gentamicin ototoxicity by lysisin aspirin in guinea pigs. METHODS: Fortyeight guinea pigs were divided into 4 groups with 12 each: gentamicin treated group (GM), Lysisin aspirin treated group (LAP), GM+LAP group and control group. Auditory brainstem response and cochlear preparation transmission electron microscope were used to evaluate the effects of hair cells on hearing threshold and the morphology of hair cells. Serum levels of GM were also tested. RESULTS: GM group developed a progressive threshold shift, reaching 50 dB at 8 kHz and the threshold shift in GM+LAP group was 30 dB (P<0.05). Injury in high frequency was significantly more severe than that in low frequency (P<0.01). Morphological results were consistent with the functional results. LAP did not affect serum levels of GM. CONCLUSION: The results suggest that LAP may be a promising therapeutic agent in reducing gentamicin ototoxicity.
【Keywords】 gentamicins/toxicity; lysisin aspirin; drug interactions
【摘要】 目的： 觀察來比林對抗慶大霉素耳毒性的作用. 方法： 將豚鼠隨機分為慶大霉素（gentamicin， GM）組、來比林組 (lysisin aspirin， LAP)、GM+LAP組及對照組，采用聽性腦干反應（ABR）、耳蝸鋪片及透射電鏡技術、觀察用前后聽閾及耳蝸毛細胞形態(tài)學改變，并檢測血清尿素氮、肌苷以及慶大霉素血藥濃度. 結果: GM組8 kHz ABR 4 wk平均閾移達50 dB，GM+LAP組平均閾移為30 dB，差異顯著(P<0.05). 形態(tài)學改變與聽力變化一致. GM+LAP組血液中丙二醛較GM組明顯減少(P<0.05). GM+LAP組超氧化物歧化酶活性明顯高于GM組(P<0.05). LAP對慶大霉素血藥濃度沒有影響. 結論： LAP能有效減輕GM的耳毒性作用，水楊酸鹽連接有其他基團并不影響拮抗耳毒性的作用. 并且更加安全,有效,方便臨床使用.
【關鍵詞】 慶大霉素/毒性；來比林；藥物相互作用
0引言
慶大霉素（GM）早期在臨床上應用較為普遍 ，其耳毒性所致的感音神經性聾較為常見. 近年有研究報道部分自由基清除劑和鐵螯合劑可以減輕氨基糖甙類抗生素的耳毒性［1,2］. 已有實驗證實水楊酸鈉作為一種自由基清除劑對慶大霉素耳毒性有作用［3,4］. 藥物來比林是乙酰水楊酸與賴氨酸的復鹽，水溶性好，酸度適宜，可作注射用，避免對胃腸道的刺激，并具有更為強力的解熱鎮(zhèn)痛作用. 我們旨在利用聽性腦干反應（ABR）、耳蝸鋪片及透射電鏡技術觀察用LAP前后聽閾及耳蝸毛細胞形態(tài)變化，測定血清中丙二醛（MDA）超氧化物歧化酶（SOD）含量，測定腎功和血清GM濃度，觀察來比林（LAP）預防慶大霉素耳毒性的作用.
1和方法
1.1材料耳廓反射正常的健康雄性雜色豚鼠，體質量250~350 g, 由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供. 硫酸慶大霉素（西安高科陜西金方藥業(yè)公司，批號 020207）,來比林（安徽新力藥業(yè)股份有限公司蚌埠涂山分廠， 批號020713）.
1.2方法
1.2.1動物分組及處理48只豚鼠隨機分為4組，每組12只. 正常對照組，不做任何處理；GM組： GM 120 mg・kg-1 皮下注射，1次・d-1，連續(xù)19 d；LAP組： LAP 120 mg・kg-1 皮下注射，2次・d-1，間隔5 h，連續(xù)19 d；GM+LAP組：第1次LAP和GM同時注射,5 h后，第2次注射LAP，劑量同上；動物實驗期間每日秤體質量調整用藥量. 用藥前及用藥后9 d, 19 d, 4 wk, 6 wk檢測ABR，第4次測ABR后每組取2只豚鼠斷頭活殺. 一耳供透射電鏡標本的制備，另一耳供光鏡觀察耳蝸鋪片.
1.2.2ABR反應閾檢測豚鼠的ABR 以Ⅲ波最著，動物在戊巴比妥鈉40 mg・kg-1腹腔注射麻醉后，針型記錄電極置前額正中皮下，參考電極置測試耳外耳道口后上皮下，鼻尖接地. 用 Biologic聲刺激器，286自動采樣，采用短純音（tone burst，上升下降時間各2 ms，平臺時間1 ms）1 kHz，8 kHz刺激，間隔75 ms，掃描時間20 ms，疊加256次，帶通濾波80~1500 Hz,在屏蔽隔聲室內常規(guī)測試.
1.2.3耳蝸硬鋪片標本制備［5］動物斷頭活殺，取出聽泡，于顯微鏡下在冰盒內快速摘除鐙骨，刺破圓窗，挑開蝸頂；用5~10 g・L-1 AgNO3灌流浸泡15 min；0.1 mol・L-1的磷酸緩沖液（pH=7.4）漂洗；25 mL・L-1戊二醛固定2 h，爆光40~60 min，再置于25 mL・L-1戊二醛固定24 h（置4度冰箱），解剖顯微鏡下常規(guī)制備，分離各圈基底膜，甘油封片.
1.2.4透射電鏡標本制備動物快速斷頭活殺，取出并打開聽泡，用25 mL・L-1戊二醛磷酸緩沖液固定，另一只耳按常規(guī)方法制作透射電鏡標本.
1.2.5管碟法測定慶大霉素血藥濃度GM組和GM+LAP組動物第9日和第19日注射慶大霉素后1 h心肌取血，測定血清抑菌環(huán)直徑，再查標準曲線圖，得出血清慶大霉素濃度.
1.2.6檢測血清中MDA,SOD用藥后9 d和19 d各組動物心肌取血. 離心，取血清-20℃凍存. 采用南京建成生物工程研究所的丙二醛、超氧化物歧化酶試劑盒，按說明操作檢測.
1.2.7檢測腎功GM組和GM+LAP組動物3 wk注射慶大霉素后心肌取血，1000 r・min-1 離心10 min，取血清凍存，全自動生化分析儀（島津CL8000,日本）測定血清尿素氮和肌苷.
學處理：運用統(tǒng)計學軟件SPSS 10.0 進行組間t，P＜0.05為有顯著性差異.
2結果
實驗中GM組3只動物死亡，死前均消瘦、耳廓反射消失、無力. GM+LAP組有一只動物死亡. LAP組及對照組中無死亡.
2.1ABR用藥后各組動物ABR出現(xiàn)閾移(Fig 1, 2). 豚鼠用藥4 wk后平均反應閾變化率達最高閾移, 1 kHz ABR GM組（28.8±2.9）dB比GM+LAP組(42.5±3.7) dB聽力損失大(P<0.05). 8 kHz ABR GM組(14.5±3.6) dB比GM+LAP組(16.8±3.7) dB聽力損失大(P<0.05). 兩組數(shù)據(jù)經方差分析差異顯著(P<0.05)，高頻聽力損失比低頻重. 對照組和LAP組的反應閾沒有明顯變化（P>0.05）.
aP＜0.05 vs GM＋LAP. GM: gentamicin; LAP: lysisin aspirin.
圖1－圖2 (略)
2.2形態(tài)學觀察用藥3 wk后耳蝸鋪片顯示GM組用藥后外毛細胞損傷（Fig 3），從頂回至底回損傷逐漸加重，內毛細胞較外毛細胞損傷輕；GM+LAP組外毛細胞損傷較GM組輕（Fig 4）；透射電鏡見GM組嚴重損傷，缺失的外毛細胞由支持細胞代替（Fig 5）. GM+LAP組病變較輕，主要為毛細胞胞質稀疏，線粒體變形空化等（Fig 6）.
圖3－圖6 (略)
2.3血清的MDA濃度和SOD活性GM組的MDA濃度高于GM+LAP組，組間差異非常顯著(P<0.01, Tab 1); 在這兩組中19 d時的均高于9 d時，兩組間差異顯著（P<0.05, Tab 1）; GM組SOD的活性低于GM+LAP組，組間差異非常顯著(P<0.01, Tab 1); 在兩組中19 d時的SOD活性，均高于9 d時，差異顯著(P<0.05, Tab 1). GM組和GM+LAP組的MDA含量和SOD活性，均高于LAP組和Blank組(P<0.01 Tab 1).
表1不同用藥時間的血清MDA, SOD含量 (略)
2.4血尿素氮(BUN), 血清GM含量和Cr檢測GM組和GM+LAP組3 wk BUN和Cr的檢測結果，兩組間差異顯著（P<0.01, Tab 2）. 兩組間血清GM含量無明顯差別(P>0.05, Tab 2).
表2不同組間的BUN, GM和Cr檢測結果 (略)
3討論
氨基糖甙類抗生素的耳毒作用機制之一為自由基學說［ 6-8］. 正常機體組織內有少量的自由基存在，病理狀況下，自由基含量會增加，其中以氧族羥基自由基為主，直接造成細胞各成分損害，引起其代謝和功能障礙. 有研究發(fā)現(xiàn)水楊酸類物可作為自由基清除劑，具有自由基拮抗劑的作用. 國內也已有相關的實驗證實水楊酸鈉可以慶大霉素的耳毒性. 水楊酸鹽在體內解離出水楊酸，水楊酸遇氧自由基可氧化生成二羥基苯甲酸，二羥基苯甲酸已被證實為有效的耳毒性拮抗劑. 但是水楊酸鈉的副作用較大,對胃腸有刺激，臨床使用中無針劑. 本實驗中所用來比林是阿司匹林與賴氨酸的復鹽（注射用賴氨匹林）已被證實具有以下特點：水溶性好，酸度適宜，可作注射用，避免了對胃腸道的刺激，并具有更為強力的解熱鎮(zhèn)痛作用； 血藥濃度高，作用強度為阿司匹林的4~5倍； 不良反應少，可以與慶大霉素配伍使用，含有適量甘氨酸，增強了賴氨匹林的穩(wěn)定性，大大減少了對注射部位的刺激性. 臨床用藥比水楊酸鈉更為安全、有效、方便. 在本實驗中GM+LAP組的ABR聽閾明顯低于GM組，說明來比林也是預防耳毒性的有效藥物. GM所致ABR閾值升高模型高頻損傷比低頻損傷嚴重，形態(tài)學變化3 wk時顯示GM+LAP組的損害比GM組損害輕. GM+LAP組主要為細胞胞質稀疏，有空泡，線粒體變形空化，溶酶體、多泡體增多. 這與以往文獻報道的結果基本相符. 實驗中慶大霉素的用量遠遠高于正常用量，而來比林的用量相當于正常的臨床用藥量，可見，來比林可在安全范圍內有效預防慶大霉素的耳毒性.
【參考文獻】
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