三種方法檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌方法的評(píng)價(jià)

三種方法檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌方法的評(píng)價(jià)

【關(guān)鍵詞】 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴(kuò)散法；微量稀釋法

　�。壅�要］ 目的：評(píng)價(jià)3種檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法，苯唑西林微量稀釋法和PCR檢測(cè)mecA基因?qū)εR床分離98株葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)并作比較。結(jié)果：98株中有63株耐甲氧西林葡萄球菌，3種檢測(cè)方法差異無(wú)顯著性。結(jié)論：頭孢西丁紙片擴(kuò)散法可作為基層醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室日常工作檢測(cè)甲氧西林的簡(jiǎn)便又準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法。

　　［關(guān)鍵詞 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴(kuò)散法；微量稀釋法

　　葡萄球菌是人類(lèi)感染的最重要的病原菌之一［1］，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin　resistant staphylococcus aureus，MRSA)所造成的院內(nèi)感染一直是臨床普遍關(guān)注的問(wèn)題，而凝固酶陰性的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant oaagulase megative staphylooocci，MRCNS)近年來(lái)報(bào)道增多，其耐藥性比凝固酶陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌更高，造成臨床治療上的困難。由耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant staphylooocci，MRS)引起的感染已經(jīng)成為臨床抗感染治療的難題之一。怎樣快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出MRS及預(yù)測(cè)其耐藥性變化對(duì)臨床治療及合理應(yīng)用抗生素都有十分重要的意義。為此，我們對(duì)MRS的檢測(cè)方法進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

　　1　材料與方法

　　1．1　材料

　　1．1.1　菌株來(lái)源　收集了2005年9月至12月本院臨床科室各類(lèi)標(biāo)本中分離的葡萄球菌共98株，并經(jīng)血漿凝固酶試驗(yàn)和法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK32全自動(dòng)微生物分析儀系統(tǒng)，配套的GPI和GNI細(xì)菌鑒定板鑒定，嚴(yán)格按照細(xì)菌鑒定程序進(jìn)行。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923。

　　1．1.2　主要試劑　GPI細(xì)菌鑒定板和GPS藥敏板條為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。頭孢西丁(30 μg)紙片為英國(guó)OXOID公司商品，藥敏試驗(yàn)所用培養(yǎng)基MuelleHinton(MH)瓊脂購(gòu)自杭州微生物試劑廠(chǎng)。mecA基因檢測(cè)引物由上海生物工程公司合成。

　　2　方法

　　2．1　最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定　用GPS-109藥敏鑒定卡在Vitek32全自動(dòng)微生物分析/藥敏系統(tǒng)測(cè)定苯唑西林MIC，遵循美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所CLSI制定的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

　　2.2　頭孢西丁紙片擴(kuò)散試驗(yàn)　按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進(jìn)行，菌液濃度0.5麥?zhǔn)蠞岫?1.5×108 CFU／ml)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥，≥20 mm為敏感，凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑≤24 mm為耐藥，≥25 mm為敏感。

　　2．3　PCR檢測(cè)mecA基因　挑取菌落置入內(nèi)含有100 μl生理鹽水的0.5 mL離心管內(nèi)，離心(15 000 r／min)5 min吸棄上清液加裂解液A(0.5%非離子去污劑)50 μl和裂解液B(200 ug／ml蛋白酶K)5 μl置55 ℃保溫1 h后置入95 ℃保溫5 min。離心(10 000 r／min)30 s，上清液即為模板。PCR引物序列P1(5’-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3’)，P2(5’-AATGGGACCAACATAACCTA-3’)，PCR反應(yīng)體系50 μl，熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃1 min，48 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀(guān)察，以224 bp處出現(xiàn)熒光條帶為mecA基因陽(yáng)性。金葡菌ATCC 25923作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照模板DNA由上海生物工程公司提供。

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