談慢性鋁暴露對(duì)大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB 活性的影響論文
鋁( Al) 是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，隨著鋁的生物利用度增加，其與許多神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)，包括阿爾茨海默病( AD) 、肌萎縮性側(cè)索硬化癥( ALS) 、帕金森癡呆和海灣戰(zhàn)爭綜合征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，Al 鹽可引起許多動(dòng)物腦內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)( NFT) 病理變化，如兔、貓、小鼠、大鼠和猴。最新的研究結(jié)果也證明，Al 暴露可導(dǎo)致腦內(nèi)產(chǎn)生AD 樣病理變化以及認(rèn)知障礙，并且飲水中Al 含量與AD 患者死亡率呈正相關(guān)。慢性Al 暴露可以增強(qiáng)AD 患者腦內(nèi)NFT 和Aβ 的形成，從而增加淀粉樣斑塊的體積和數(shù)量。在神經(jīng)元中，鈣離子( Ca2 + ) 持續(xù)性升高可造成神經(jīng)毒性，與急慢性神經(jīng)退行性病變中的神經(jīng)損傷密切相關(guān)。神經(jīng)元內(nèi)的Al 可以影響靜息Ca2 + 水平，減慢Ca2 + 流出細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，Al 可以抑制調(diào)節(jié)Ca2 + 的相關(guān)蛋白表達(dá)。因此，了解鋁暴露對(duì)Ca2 + 穩(wěn)態(tài)的影響對(duì)于明確鋁神經(jīng)毒性的機(jī)制，具有十分重要的意義。Ca2 + /鈣調(diào)蛋白( CaM) 依賴的蛋白激酶Ⅱ( CaMKⅡ) 是神經(jīng)細(xì)胞興奮性轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的關(guān)鍵媒介，也是突觸可塑性改變的關(guān)鍵蛋白。此外， cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白( CREB) 是CaMKⅡ的下游分子之一，在突觸可塑性中具有重要作用，激活CREB 可促進(jìn)多種與突觸可塑性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生一些與學(xué)習(xí)記憶十分相關(guān)的蛋白分子。研究表明，Al 在腦內(nèi)特定的敏感區(qū)域內(nèi)選擇性地沉積，如海馬區(qū)等。但是，慢性Al 暴露對(duì)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2 + 穩(wěn)態(tài)以及其下游CaMKⅡ、CREB 信號(hào)分子活性的影響尚未見報(bào)道。
1 材料與方法
1. 1 主要材料
選擇60 只斷乳后Wistar 大鼠( 體重約30 g) ，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CREB 抗體、磷酸化( p) -CREB 抗體( Cell Signal 公司) ; CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體、神經(jīng)顆粒素( Ng) 抗體( 美國SANTA Cruz 公司) 、β 肌動(dòng)蛋白( β-actin) 抗體、辣根過氧化物酶( HRP) 標(biāo)記的二抗( 北京中杉生物公司) ; ECL 發(fā)光試劑( 美國Sigma 公司) 、Chemilmager 5500V2103( 美國) 。其他試劑均為分析純。
1. 2 動(dòng)物
模型建立將60 只( AlCl3) 大鼠隨機(jī)分3 組，每組20 只。對(duì)照組用蒸餾水喂養(yǎng)，Al 暴露組分別用含有0. 2% 和0. 4%氯化鋁的蒸餾水喂養(yǎng)。動(dòng)物室溫度保持在18℃ ～ 23℃、相對(duì)濕度為45% ～ 55%，光照時(shí)間12 h∶ 12 h。Al 暴露大鼠保持健康，體重為對(duì)照大鼠的( 90 ± 6) %。3 個(gè)月后，進(jìn)行大鼠學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)及其他生化指標(biāo)測定。
1. 3 Morris 水迷宮測定
大鼠學(xué)習(xí)記憶行為參考文獻(xiàn)的方法，Morris 水迷宮測試在內(nèi)徑180 cm、高60 cm 的圓形水池中進(jìn)行。水深48 cm，水溫為( 22 ± 0. 5) ℃，水池內(nèi)放入奶粉使之成為乳白色。將水池分為西南、西北、東南和東北( SW、NW、SE和NE) 四個(gè)象限，NW 象限正中距池壁20 cm 處放置逃避平臺(tái)( 直徑約8 cm) ，平臺(tái)位于水下2 cm。水池正上方安裝帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并記錄游泳軌跡，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)迷宮外參照物保持不變。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，簡單地說，實(shí)驗(yàn)大鼠每天游泳4 次，分別從不同象限將動(dòng)物頭朝池壁入水，并在水池上標(biāo)定相同一點(diǎn)作為每次實(shí)驗(yàn)大鼠的入水點(diǎn)，尋找平臺(tái)時(shí)間上限設(shè)置為120 s。如果在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)并停留30s 以加強(qiáng)記憶，緩解緊張情緒。逃避潛伏期記錄為120 s，每只大鼠的游泳時(shí)間間隔為15 min。觀察和記錄120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間占總時(shí)間的百分比和在原平臺(tái)象限搜索距離占總距離的百分比，并記錄大鼠在120 s 內(nèi)搜索平臺(tái)的路線圖。空間探索實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行1 次。
1. 4 腦組織和血液中Al 含量測
定根據(jù)文獻(xiàn)，準(zhǔn)確分離并稱取各組大鼠海馬組織( 約0. 1 ～ 0. 5 g) 或準(zhǔn)確吸取0. 2 ～0. 5 ml 的全血于石英燒杯中，放入聚四氟乙烯( PTFE) 中，加入5 ～ 8 ml 混酸( 硝酸∶ 高氯酸體積比為4∶ 1) ，同時(shí)做空白對(duì)照。低溫加熱至試樣全部溶解，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至近干后加0. 2% 硝酸溶解殘留物，并以0. 2% 硝酸定容至50 ml，采用石墨爐原子吸收分光光度法測定腦鋁或血鋁含量。
1. 5 大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2 + 含量測定〔20〕冰上分離大鼠
海馬組織后，放入D-Hank 液中。37℃ 下用0. 125% 胰酶消化20 min，反復(fù)吹打后離心，制備密度為106 ～ 107 個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，確定分離出的單細(xì)胞存活率在95% 以上。將終濃度為4 μmol /L 的Fura-2 /AM 加入上述分離出來的細(xì)胞懸液中， 37℃下孵育35 min 后，用含0. 2% BSA 的Hank 液清洗殘留的Fura-2 /AM。然后，將細(xì)胞重懸于無Mg2 + 的Hank 液中( mmol /L) : HEPES 10，KCl 5. 0，NaCl 145，CaCl2 1. 3，L-glucose10，Na2HPO4。采用日立F-3000 型熒光雙波長分光光度計(jì)測定細(xì)胞Ca2 + 濃度。激發(fā)光波長設(shè)定為340 ～ 380 nm，發(fā)射光波長為510 nm。根據(jù)下面公式計(jì)算Ca2 + 濃度〔Ca2 +〕i = Kd〔( R -Rmin) /( Rmax - R) 〕( Fmin /Fmax) 。Kd 值為224 nmol /L，R 為熒光值，〔Ca2 +〕i為nmol /L，而Fmin 為加入EGTA 后測得的熒光值，F(xiàn)max 為加入TritonX-100 后測得的熒光值。
1. 6 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)PCR 法檢測mRNA 表達(dá)
冰上分離各組大鼠海馬組織，按照TRIzol 說明書( Invitrogen，USA) 抽提各組海馬組織的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度儀測定RNA 樣品260 /280 nm 波長處吸光度比值為1. 9 ～ 2. 0。根據(jù)試劑盒說明書要求，采用oligo ( dT) 和super script Ⅱ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，用雙標(biāo)記熒光探針混合物( SYBR Green PCR Master mix) 在ABI prism7500自動(dòng)序列分析系統(tǒng)( Biosystems) 中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 分析，每組重復(fù)3 次。CaMKⅡ基因引物特異序列分別為5'-AGCCATCCTCACCACTAT-3' ( 上游) 和5'-CTTCACGCCATCATTCTTC-3'( 下游) ; CREB 基因引物特異序列分別為: 5'-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3' ( 上游) 和5'-TTACACTATCCACAGACTCCT' ( 下游) ; β-actin 作為內(nèi)參照，其引物特異序列為5'-GAG ACC TTCAAC ACC CCA GCC-3'( 上游) 和5'-GGA TCT TCA TGA GGTAGTCA G-3'。兩種基因擴(kuò)增結(jié)果用β-actin 進(jìn)行標(biāo)化。
1. 7 免疫印跡檢測
蛋白表達(dá)采用頸椎脫臼法處死大鼠，冰上分離大鼠海馬，剔除血管。在每個(gè)裝有海馬的離心管中，按照1∶ 9比例加入裂解液( 10 mmol /L Tris-HCl pH 7. 5，1mmol /LEDTA，1 mmol /L EGTA， 100 mmol /L NaCl， 50 mmol /L NaF，1%TritonX-100，1mmol /L Na3VO4，1mmol /L PMSF) ，1μg /ml 亮肽素，1μg /ml 抑蛋白酶( Santa Cruz，USA) ， 50 mmol /L β-glycerolphosphate，1 mmol /L 二硫蘇糖醇和0. 09% Brij-35。4℃下超聲粉碎后27 000 g 離心1. 5 h，取上清，即總蛋白提取液。BCA 蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，取50 μg 總蛋白，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳( 110 V，2 h) 。待電泳完成后，把蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素( NC) 上。分別用抗tCREB、p-CREB( Ser133) ( 1∶ 100) 、Ng( 1 ∶ 500) 、p-CaMKⅡ( 1 ∶ 500) 和β-actin( 1∶ 1 000) 抗體孵育，最后加入HRP 標(biāo)記的相應(yīng)二抗，ECL 發(fā)光并成像分析。
1. 8 免疫組化檢測
蛋白表達(dá)各組大鼠經(jīng)4% 多聚甲醛灌流固定后取海馬組織，30% 蔗糖( 用4% 多聚甲醛配置) 后固定48 h，冷凍切片( 40 μm/片) 。分別經(jīng)0. 3% 過氧化氫甲醇溶液、0. 3% Triton-100 處理后， 0. 01 mol /L PBS 清洗5 min × 3 次。加入一抗CaMKⅡ( 1∶ 200) 4℃孵育過夜、二抗( 1∶ 1 000) 室溫下孵育2 h、DAB 法顯色。
1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS11. 0 軟件，組間資料統(tǒng)計(jì)用單因素方差分析( ANOVA) 。采用單因素重復(fù)測量方差分析評(píng)估行為學(xué)數(shù)據(jù)。
2 結(jié)果
2. 1 慢性Al 暴露可誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷Morris 水迷宮測試結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，鋁暴露各組大鼠的穿越平臺(tái)次數(shù)、在原平臺(tái)象限搜索時(shí)間占總時(shí)間的百分比和在原平臺(tái)象限搜索距離占總距離的百分比顯著降低( P < 0. 05) ; 在慢性Al 暴露各組之間， 0. 4% AlCl3組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和搜索距離明顯低于0. 2% AlCl3組( P < 0. 05) ，呈現(xiàn)劑量依賴性; 各組搜索時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2. 2 慢性Al 暴露可增加大鼠血Al 和海馬組織內(nèi)Al 的含量與對(duì)照組相比較，Al 暴露各組大鼠的血液和海馬組織中Al 含量明顯增加( P < 0. 05) ; 在Al 暴露各組大鼠之間，0. 4% AlCl3__組大鼠的血Al 和海馬組織Al 含量明顯高于0. 2% 組( P<0. 05) 。
2. 3 慢性Al 暴露可增加大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的自由鈣離子( 〔Ca2 +〕i) 濃度與對(duì)照組相比，Al 暴露各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)〔Ca2 +〕i明顯增高，從( 155. 75 ± 15. 33) nmol /L( 對(duì)照組)分別增至( 515. 92 ± 53. 59 ) nmol /L ( 0. 2% AlCl3組) 和( 646. 87 ± 62. 32) nmol /L( 0. 4% AlCl3組) ; 與0. 2% AlCl3組相比， 0. 4% AlCl3組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)〔Ca2 +〕i顯著升高( P< 0. 05) 。
2. 4 慢性Al 暴露對(duì)CaMKⅡ和CREB mRNA 表達(dá)的影響各組CaMKⅡ及CREB mRNA 表達(dá)無顯著變化( P > 0. 05) 。對(duì)照組設(shè)為1， 0. 2% AlCl3組與0. 4% AlCl3組CaMKⅡ mRNA 表達(dá)量分別為0. 98 ± 0. 21、1. 11 ± 0. 18，CREB mRNA 表達(dá)量分別為0. 99 ± 0. 19、1. 03 ± 0. 15。
2. 5 慢性Al 暴露對(duì)CaMKⅡ和CREB 總蛋白表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，各組CaMKⅡ染色密度元顯著差異( P >0. 05) 。同時(shí)，Western 印跡結(jié)果也顯示( 圖1) ，各組CREB 總蛋白表達(dá)水平無顯著變化( P > 0. 05) ，CREB 總蛋白表達(dá)分別為0. 55 ± 0. 065 ( 對(duì)照組) 、0. 54 ± 0. 062 ( 0. 2% AlCl3組) 和0. 57 ± 0. 064( 0. 4% AlCl3組) ( P > 0. 05) 。
2. 6 慢性Al 暴露影響學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵蛋白分子CaMKⅡ和CREB 的活性與對(duì)照組相比，Al 暴露組大鼠海馬組織中p-CaMKⅡ、Ng 和p-CREB 表達(dá)水平均明顯降低( P < 0. 05) ; 同時(shí)，隨著Al 暴露濃度的增加，p-CaMKⅡ、Ng 和p-CREB 表達(dá)逐漸降低，呈劑量依賴性( P < 0. 05) 。
3 討論
Al 暴露因素是AD 發(fā)病機(jī)制中研究最多的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素。Al 在神經(jīng)系統(tǒng)中的蓄積可產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，從而引起智力和認(rèn)知能力的缺欠。同時(shí)，AD 患者腦Al 含量較高，神經(jīng)原纖維纏結(jié)( NTFs) 中含有高濃度的Al。因此，研究Al暴露與AD 的關(guān)系十分重要。Morris 水迷宮行為學(xué)評(píng)估結(jié)果證明，慢性Al 暴露確實(shí)可以造成大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷，這些結(jié)果與以往國內(nèi)外一些研究的結(jié)果相似。Ca2 + 對(duì)真核細(xì)胞的代謝及各種生理功能具有十分重要的作用，并且細(xì)胞外Ca2 + 濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)Ca2 + 濃度。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca2 + 作為最基本的第二信使，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)控突觸可塑性，甚至是基因表達(dá)。有研究表明，Al3 + 離子半徑與Ca2 + 相似，可以與Ca2 + 結(jié)合位點(diǎn)作用，從而在一定程度上影響細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。在體外培養(yǎng)的條件下，Al暴露后可顯著提高星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2 + 濃度。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，慢性Al 暴露可顯著提高大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2 + 濃度，并呈劑量依賴性。此結(jié)果與慢性Al 暴露可顯著增加神經(jīng)突觸內(nèi)鈣濃度的研究結(jié)果相似。
CaMKⅡ是空間學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)，Ca2 + 內(nèi)流可磷酸化激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ從細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)到突觸并結(jié)合NMDA 型谷氨酸受體，而CaMKⅡ-NMDA 受體復(fù)合物是誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)的關(guān)鍵分子。研究表明，在LTP 后期，CaMKⅡ具有放大并強(qiáng)化突觸可塑性的結(jié)構(gòu)性功能。我們的結(jié)果證明，慢性Al 暴露并未影響大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ總蛋白的表達(dá)，但是卻降低了p-CaMKⅡ的表達(dá)，說明Al 暴露可抑制CaMKⅡ的活性。Ng 是一種突觸后蛋白，可以與CaM 單體結(jié)合，對(duì)于CaMKⅡ的活性具有重要的影響。研究表明，Ng 增高可以增加CaMKⅡ激活，從而增強(qiáng)突觸可塑性; 而在Ng 敲除的小鼠中，CaMKⅡ的活性也明顯降低。我們的結(jié)果表明，Al 暴露可以降低大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞中Ng 的蛋白表達(dá)。因此，總體來說，慢性Al 暴露干擾了大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)，降低了p-CaMKⅡ和Ng 的蛋白表達(dá)，這可能是Al 暴露誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷、誘導(dǎo)AD 發(fā)病的機(jī)制之一。
CREB 是一種分子量為43 kD 的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，對(duì)于神經(jīng)突觸可塑性長時(shí)間的改變具有十分重要的作用。CREB上的絲氨酸( Ser) 133 是許多蛋白激酶的作用靶點(diǎn)，例如CaMKⅡ和Ⅳ、蛋白激酶A 和蛋白激酶C 等。一旦Ser-133 位點(diǎn)被磷酸化，CRE 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄即刻啟動(dòng)，從而最終激發(fā)LTP 相關(guān)蛋白的合成。本結(jié)果證明，慢性Al 暴露顯著抑制p-CREB( S133) 的表達(dá)，但是CREB 總蛋白表達(dá)未受到顯著影響。這可能是由于p-CaMKⅡ蛋白的降低抑制了CREB( S133) 磷酸化過程。綜上所述，本文結(jié)果表明慢性Al 暴露損傷了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是由于Al 暴露造成了海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂，從而抑制了CaMKⅡ/CREB 通路。除此之外，Al 暴露還抑制了海馬神經(jīng)細(xì)胞的Ng 蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制了CaMKⅡ的激活。
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